唐双焱研究组改造SspB蛋白设计并获得适用于合成生物学研究的新型蛋白降解工具

SspB-ssrA系统是介导错误翻译蛋白特异性降解的系统，广泛存在原核生物和一些真菌中。近年来，SspB-ssrA系统被运用于合成生物学研究中，作为蛋白降解工具从翻译层面调控基因表达，但其较低的降解效率极大限制该系统的广泛运用。中国科学院微生物研究所唐双焱研究组长期致力于合成生物学工具研发和蛋白定向进化工作，近期，该团队改造SspB蛋白设计并获得了适用于合成生物学研究的新型蛋白降解工具。

SspB-ssrA系统工作机制是：细胞中损伤的蛋白，或需要被降解的蛋白，其C端首先被特殊的tmRNA添加上ssrA标签，随后SspB蛋白可识别ssrA标签并牵引被ssrA标签标记的蛋白靠近ClpXP蛋白水解酶。进而，SspB蛋白结合ClpXP蛋白水解酶，被ssrA标签标记的蛋白进入ClpX蛋白酶中去折叠，再传递进ClpP蛋白酶切割水解。同时，SspB蛋白从ClpXP蛋白水解酶上解离释放。

大肠杆菌中SspB蛋白由165个氨基酸组成，按功能可分为底物结合域、ClpX酶结合域及两个结合域中间一段松散的肽链三部分；ssrA标签是由11个氨基酸（AANDENYALAA）组成的肽链，可被SspB蛋白特异性识别。

该团队首先设计构建了响应SspB-ssrA系统降解效率的高通量筛选系统，而后筛选SspB或ssrA饱和突变文库，获得四套高效工作的SspB-ssrA系统和一套响应新ssrA标签的SspB-ssrA系统。进而，利用等温滴定量热法和免疫印迹技术等测试SspB突变体和ssrA突变体之间的相互作用力，并结合计算机模拟，探究SspB-ssrA系统工作机制。最终，将进化获得的SspB-ssrA系统运用于衣康酸和阿魏酸合成的调控中，显著提高了目标产物的合成产量。

本项研究成果已发表在期刊Metabolic Engineering上，题为“Engineering an SspB-mediated degron for novel controllable protein degradation”。中国科学院微生物研究所唐双焱研究组2017级直博生雷严严为该论文第一作者，中国科学院微生物研究所唐双焱研究员、梁朝宁副研究员和北京工商大学金建明教授为共同通讯作者。本项研究工作获得了国家重点研发计划、国家自然科学基金和博士后科学基金的支持。

论文链接：https://doi.org/10.1016/j.ymben.2022.10.013。

图1：SspB-ssrA介导的蛋白降解系统示意图

图2：（a-b）验证SspB-ssrA系统功能。（c）构建筛选SspB-ssrA系统降解效率的生物传感器。（d）检测生物传感器功能。（e）SspB-ssrA复合物晶体结构分析。

图3：（a）检测野生型SspB蛋白对新ssrA标签的亲和力。（b）构建响应新ssrA标签的SspB蛋白筛选系统。（c）流式筛选响应新ssrA标签的SspB蛋白。（d）响应新ssrA标签的SspB突变体。（e）SspB突变体时间曲线。（f）SspB突变体模拟结构。（g-h）检测SspB突变体对新ssrA标签的亲和力。