向华和李明研究团队揭秘CRISPR护卫RNA独特的进化之路

CRISPR-Cas9基因组编辑技术促进了整个生命科学领域的发展，该技术核心元件来源于微生物的CRISPR-Cas免疫系统。CRISPR-Cas是广泛分布于细菌和古菌中的适应性免疫系统，可以抵御噬菌体和质粒等遗传元件的入侵。同时，噬菌体往往会携带anti-CRISPR蛋白失活Cas蛋白，各种活跃的遗传因子（如IS）也会插入破坏cas基因，这些因素对CRISPR-Cas系统造成巨大的进化压力。 

2021年，中国科学院微生物研究所向华/李明研究团队在国际顶级学术期刊《Science》上报道了一类全新的可以护卫CRISPR-Cas的双RNA型毒素-抗毒素系统CreTA（Science, 2021），为人们理解CRISPR-Cas系统在微生物中的广泛分布（约50%的细菌和90%的古菌中）提供了重要线索。 

CreTA的发现不仅揭示了天然CRISPR-Cas系统的“细胞成瘾”机制和自私特性，而且促进了新的TA分类单元（第VIII型）的建立（Nature Reviews Microbiology, 2022）。该团队进一步的研究发现，CreTA起源于mini-CRISPR结构并发生了高度退化（即重复序列repeat序列保守性降低），这为CreTA的系统性发掘提供了关键的参数（Nucleic Acids Res, 2021）。然而，CreTA为何会发生这种repeat序列的退化，这一退化过程的进化驱动力是什么，科学家们尚不清楚。近日，李明团队和向华团队在国际知名学术期刊Nucleic Acids Research上报道了他们关于CRISPR护卫RNA的最新研究进展，回答了这一科学问题。 

近缘的CRISPR-Cas系统一般具有相同或高度相似的repeat序列，因此它们可以通过HGT（横向基因转移）过程共享CRISPR结构及其存储的病毒序列信息（spacer）（图1A）。然而，该研究团队基于大量遗传学实验发现，虽然CreTA起源于mini-CRISPR，但它在近缘CRISPR-Cas系统之间一般是无法通用的，即CreA只能利用携带该CreTA元件的CRISPR-Cas系统（而无法利用近缘的CRISPR-Cas系统），抑制CreT毒素的转录表达并形成“细胞成瘾”回路（图1B）。如此一来，每个CRISPR-Cas基因簇都进化出了自己独有的护卫RNA，这可能促进了CRISPR-Cas系统的深度分化和多样化形成。另外，该团队通过进化分析发现，虽然其两个repeat组分都发生了严重的序列保守性退化，但第一个repeat（ΨR1）的退化更为严重，而通过对该repeat组分进行改造，可以大大提高CreTA与近缘CRISPR-Cas系统的适配性，为CRISPR护卫RNA元件的人工设计和应用提供了重要依据。 

CRISPR结构中repeat序列的高度保守性不仅提高了其在近缘系统中的通用性，而且可以通过频繁的同源重组促进“陈旧”spacer信息的丢失，并在适应复合物的帮助下获取新的spacer，赋予CRISPR以动态和适应性（图1A）。该研究团队认为CreA repeat序列的退化可以从根本上杜绝内部重组事件的发生，因为一旦重组将导致CreT表达释放和菌体死亡（图1B）。利用CreA高度稳定且保留了Cas6加工识别关键位点的这一特性，他们将基因编辑应用中人工CRISPR结构的保守repeat序列替换为CreA退化的repeat，结果显著提高了CRISPR工具的稳定性和编辑效率（图1C），这为开发高效稳定的CRISPR工具提供了新元件和新思路。 

上述研究阐述了起源于mini-CRISPR的护卫RNA元件（CreTA）通过“序列退化”实现了“功能进化”的独特进化之路，揭示了其通过repeat退化提高自身稳定性，以及高度特异地保护其附近CRISPR-Cas基因簇的分子机制，并为CRISPR工具的创新升级提供了新思路。 

该研究于2022年8月26日在Nucleic Acids Research上在线发表，得到了所有审稿人高度正面（all extremely positive）评价，他们认为该研究工作对于人们理解CRISPR做出重要贡献（an important contribution to the field），并对多重CRISPR技术的创新提供了重要的原理证明（an important proof of principle）。中国科学院微生物研究所李明团队的博士后程飞跃、硕士生伍蔼慈和博士生刘超为该论文的并列第一作者，微生物研究所李明研究员和向华研究员为该论文的共同通讯作者。该研究得到了国家自然科学基金、中科院战略先导研究计划、中国科学院青年创新促进会和博士后创新人才支持计划等项目的经费支持。 

图1. （A和B）保守的CRISPR repeat和退化的CreTA repeat的生物学意义;（C）利用creTA退化的repeat序列提高CRISPR基因编辑工具的稳定性和编辑效率 

（Nucleic Acids Research，https://doi.org/10.1093/nar/gkac712） 

全文链接： 

https://academic.oup.com/nar/advance-article-abstract/doi/10.1093/nar/gkac712/6677323