其他成果
一、沙粒病毒
沙粒病毒属于沙粒病毒科(Arenaviridae)，是一类有囊膜的、分节段单股负链RNA病毒。其中，哺乳动物沙粒病毒属(Mammarenavirus)是目前唯一可引起人类患病的病毒类群，典型代表为旧大陆沙粒病毒群(Old World Arenavirus)中的拉沙病毒(Lassa virus, LASV)，还有新大陆沙拉病毒群(NewWorld Arenavirus)中的马秋波病毒(Machupo virus，MACV)。LASV 主要流行于非洲国家，每年可造成30,000-50,000人感染，约5000人死亡，病死率高达20%。目前针对大多数沙粒病毒感染尚没有特效药物与疫苗，相关疾病的治疗仍具有较大困难。由于沙粒病毒的复制主要依赖于病毒自身合成的聚合酶来完成，并且这一分子机器在不同种类的沙粒病毒中相对较为保守，这使其成为抗病毒药物研发的重要靶标。因此，揭示沙粒病毒聚合酶的工作机制对于研发特效及广谱抗病毒药物具有至关重要的意义。
为了系统地研究沙粒病毒的复制机制，我们分别选取了旧大陆沙粒病毒群的代表拉沙病毒（Lassa virus, LASV）以及新大陆沙粒病毒群的代表马秋波病毒（Machupo virus, MACV）来展开研究。利用冷冻电镜技术，首次解析了其近原子分辨率三维结构。结构显示，沙粒病毒聚合酶的整体构造与流感病毒及布尼亚病毒聚合酶较为类似，表明分节段单股负链RNA病毒在进化上遗留的保守特征。尤为特殊的是，沙粒病毒聚合酶的催化位点处于天然开启的活性构象，而流感病毒以及布尼亚病毒聚合酶需要通过病毒RNA启动子的5’末端来激活这一状态。此外，我们还发现沙粒病毒聚合酶具有一个独特的插入结构域，并且生化实验表明该结构域对于聚合酶的催化活性具有重要调节作用。
为了进一步了解沙粒病毒聚合酶与病毒RNA的识别模式及调控机制，研究团队又解析了MACV聚合酶与病毒RNA启动子复合物的精细三维结构。发现病毒RNA的3’末端结合位点与之前报道的布尼亚病毒和流感病毒聚合酶相应结合位点一致，这一发现为靶向分节段单股负链RNA病毒的广谱抗病毒药物研发提供了一个理想的候选靶点。同时，我们还观察到病毒RNA的3’末端与聚合酶结合能够显著促进其形成同源二聚体，并且突变二聚体相互作用界面上的关键氨基酸位点严重抑制了聚合酶的活性。通过序列分析发现，该二聚体结合面在所有哺乳动物沙粒病毒聚合酶中较为保守，表明这一作用过程可能是沙粒病毒中一种广泛存在的调控机制。（Nature，2020）。
图1 拉沙病毒和马秋波病毒聚合酶的整体三维结构
此外，我们进一步研究了沙粒病毒基质蛋白Z 调控聚合酶活性的分子机理。前期功能研究表明，在沙粒病毒复制过程晚期，Z 蛋白能够与L 蛋白直接相互作用来抑制其RNA 合成，从而开始新生病毒粒子的组装过程。我们分别解析了LASV 和MACV L 蛋白与其相应基质蛋白Z 结合的复合物结构，以及L-Z 二元复合体与3’-vRNA 结合的三元复合体结构。结构显示Z 蛋白结合在聚合酶的手掌结构域（Palm）外围，与RNA 结合位点相距甚远，因此并不影响聚合酶招募RNA 模板。虽然L-Z 相互作用并未涉及催化位点，但Z 蛋白结合在聚合酶中两个催化基序（motifs D and E）的远端，并处于多个结构域临近界面上，阻碍了聚合酶催化元件在RNA 合成过程中的构象变化，从而使聚合酶失去催化活性。通过分析L-Z 相互作用界面，我们发现Z 蛋白通过其中间结构域与L 蛋白结合，其中一段高度保守的疏水性loop 主导了与L 蛋白的相互作用。由于此主导结合基序高度保守，我们观察到LASV 和MACV Z 蛋白和L 蛋白能够在体外呈现交叉抑制效果，这一现象表明OW 和NW 沙粒病毒Z 蛋白调控L 蛋白RNA 合成的保守机制，同时也为开发广谱抗沙粒病毒药物提供了新的思路（Nature Microbiology，2021）。
图2 Z蛋白抑制L蛋白活性的分子机制
二、猴痘病毒
猴痘病毒（MPXV）属于痘病毒科、脊索病毒亚科的正痘病毒属，同属于正痘病毒属的还有痘苗病毒（VACV），牛痘病毒（CPXV）以及天花病毒（VARV）。猴痘病毒首次发现于1958年，继1970年出现首个人感染病例后，猴痘病毒长期在非洲中西部地区局部流行，演化出西非（Clade II）和中非（Clade I）两个分支。2022年开始，猴痘病毒出现全球流行，并在两年时间内出现了新的传播方式和新的变异株Clade Ib，于2022年7月和2024年8月两次被世卫组织首次宣布为全球突发公共卫生事件。我国已出现Clade Ib毒株聚集性感染，猴痘疫情防控面临严峻挑战。
猴痘疫情在全球暴发后，高福院士团队迅速布局，在猴痘病毒基础研究、猴痘疫苗和猴痘抗体3个方向开展工作，分别研究了猴痘病毒聚合酶全酶工作的分子机制，开发了新型猴痘蛋白亚单位疫苗与mRNA疫苗，开发了新型猴痘治疗性抗体。
1、猴痘病毒聚合酶全酶工作的分子机制
猴痘病毒是被科学家长期忽视的传染性病原，正痘病毒聚合酶全酶复合物的高分辨结构以及基因组可持续合成的分子机制有待深入研究。猴痘病毒DNA复制依赖由聚合酶F8、可持续因子E4和A22异二聚体组成的全酶复合物。研究团队通过冷冻电镜首次解析了猴痘病毒聚合酶全酶复合物处于复制构象的高分辨率结构，揭示了其基因组可持续合成的分子机制。该复合物结构包含F8、A22、E4亚基、双链DNA及dTTP底物。其中，F8和E4分别具有典型DNA聚合酶和尿嘧啶糖苷水解酶特征，A22通过N端和C端结构域桥接二者，其中间结构域呈现退化的连接酶折叠特征。与未结合DNA的痘苗病毒聚合酶相比，猴痘病毒聚合酶在复制时发生显著构象变化：手指结构域旋转17°使正电残基与dNTP相互作用，拇指结构域形成正电凹槽稳定DNA。聚合酶主要与DNA的磷酸骨架结合，与碱基的相互作用极少，保障序列非依赖性延伸。研究首次发现A22-E4异二聚体通过与F8直接相互作用，形成闭合模板通道形成“前置滑动夹”，替代传统B家族聚合酶依赖的PCNA蛋白功能，防止模板DNA解离，显著提升可持续合成能力。这区别于PCNA三聚体包裹DNA产物形成的“后置滑动夹”机制。该成果阐明了痘病毒独特的DNA复制模式，为开发靶向聚合酶全酶的抗病毒药物提供了关键结构依据，推动了针对猴痘等正痘病毒治疗策略的研发进程。以上研究结果发表在Science杂志。
图 3 猴痘病毒DNA聚合酶全酶复合物的整体结构
2、新型猴痘疫苗
猴痘疫苗的一个显著特点是，需要多种抗原联合的多价疫苗才能获得最佳的保护效果。研究团队此前开发了基于抗原结构的疫苗免疫原理性设计策略。基于此策略的新冠病毒重组蛋白亚单位疫苗ZF2001已在国内及4个海外国家获批使用，全球累计接种超3.5亿剂次。基于相似的研发策略，团队根据猴痘抗原的结构生物学特点和宿主免疫应答机制，设计了多种抗原合一的二价嵌合猴痘蛋白亚单位疫苗与三价嵌合mRNA-LNP疫苗。
猴痘二价嵌合蛋白亚单位疫苗可维持已知中和表位完整性，在小鼠实验中极大地提高了各抗原的免疫原性和对痘苗病毒的中和抗体水平，表现出对高致死剂量痘苗病毒感染的完全保护和脏器内病毒的快速清除能力，且其激发的针对猴痘病毒的中和抗体滴度远高于痘苗天坛株弱毒活疫苗（28倍）。以上研究结果发表在Nature Immunology杂志。目前，上述蛋白亚单位疫苗已授权君实生物进行工业化开发，正在进行临床前毒力、药理、成药性和制剂工艺研究，同时开展猴感染模型保护性评价，预计2025年一季度申报国内临床试验许可。
猴痘三价嵌合mRNA疫苗在小鼠中可诱导出高效的体液免疫与细胞免疫，维持抗体水平在免疫近6个月后基本不变，高效中和痘苗病毒与猴痘病毒，实现了对致死剂量痘苗病毒感染的完全保护。同样剂量下接种痘苗天坛株弱毒活疫苗的小鼠全部死亡。猴痘病毒攻毒后，接种嵌合三价mRNA-LNP疫苗的小鼠个器官中的病毒载量显著低于未接种组。猴痘全球疫情暴发以来，mRNA疫苗成为国内外新一代猴痘疫苗的普遍选择，主要的设计策略为将多种表达单一猴痘抗原的mRNA-LNP疫苗进行混合，制备多价疫苗。与混合多价疫苗相比，嵌合多价mRNA-LNP疫苗实现了将三种猴痘抗原整合在一条mRNA上，具备更低的生产难度，因而有望获得更大的成本优势、更简单的生产工艺以及更广的疫苗可及性。以上研究结果发表在eBioMedicine杂志。目前，该疫苗已授权石药集团进行疫苗的进一步开发、临床申报和上市销售。预计2025年取得国内临床试验许可。
图 4 新型猴痘蛋白亚单位疫苗和mRNA疫苗
3、猴痘治疗性抗体
团队依托“平急一体”的抗体研发平台，鉴定分离出两株靶向猴痘病毒B6R抗原上不同表位的单克隆抗体，hMB621和hMB668。两株单克降抗体均表现出了对B6R及其在痘苗病毒、天花病毒和牛痘病毒中同源蛋白的广谱结合能力，且均对痘苗病毒表现出强效的中和作用。在小鼠攻毒实验中，两株单克隆抗体均展现出对致死剂量痘苗病毒攻毒的有效保护。通过解析了B6R和hMB668的复合物结构，研究首次揭示了B6R的结构特点以及抗体的结合表位。以上研究结果发表在Nature Communications杂志。目前，团队正积极寻求与企业合作，力争将该抗体药物作为应急储备的重要选项。
图 5 猴痘病毒治疗性抗体