非洲猪瘟病毒
非洲猪瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）是一种大型DNA病毒，可引发致命的猪出血性疾病，给中国造成了数以千亿计的经济损失。
通过冷冻电镜结构研究，我们发现非洲猪瘟病毒在多层结构和二十面体形态方面，与其他核质大DNA病毒有非常大的区别，其拥有极为特殊的五层结构，由内向外分别为拟核，核壳，内膜，衣壳以及外膜。通过“分块重构算法”还得到了近原子分辨率的病毒衣壳结构，鉴定出来了几种非常关键的衣壳蛋白和结构元件。外壳层由 8280个主要衣壳蛋白p72和60个五邻体蛋白组成。p72三聚体蛋白构成了外壳的大部分，而五邻体蛋白则形成顶点。在外壳层下方是由至少8340个次要衣壳蛋白形成的网络，目前鉴定出来有3种不同的类型（分别命名为 P1、P2、P3）。与其他核质大DNA病毒一样，次要衣壳蛋白位于相邻壳粒之间的交界面，可能起到稳定整个衣壳的作用。我们的研究结果揭示了非洲猪瘟病毒衣壳结构的完整分子模型，将有助于未来多种抗病毒策略的开发（Cell host & Microbe, 2019）。
非洲猪瘟病毒整体三维结构
除此之外，在非洲猪瘟病毒编码的众多蛋白质中，A137R也是一种关键的结构蛋白，与病毒的毒力相关。本团队通过冷冻电镜单颗粒重构技术解析了A137R结构。该结构显示，A137R会自我寡聚，形成一个由60个聚合物构成的独特的十二面体笼状结构。A137R笼状结构是非洲猪瘟病毒粒子的核心组成部分，同时也为纳米技术应用提供了一种很有前景的分子支架，为开发针对非洲猪瘟的疫苗或治疗方法开辟了新途径（J Virol, 2024）。
A137R组装成十二面体笼状结构
ASFV的复制主要发生在宿主细胞的病毒工厂中，涉及众多病毒复制蛋白元件。本团队首先聚焦ASFV复制蛋白元件--核酸结合蛋白pA104R，阐明了pA104R通过反复结合和弯折病毒核酸，实现压缩病毒基因组、帮助病毒基因组组装的功能机制。在此基础上，我们靶向pA104R与病毒基因组的互作界面，筛选到了两种病毒抑制剂，实现了细胞水平高于90%的病毒抑制率，为靶向复制阶段的抗ASFV药物设计和疫病防控提供了重要依据（Proc Natl Acad Sci U S A，2020）。
基于上述成果，本团队将目光投向了同样在ASFV复制阶段中发挥重要作用的II型DNA拓扑异构酶pP1192R。DNA拓扑异构酶在DNA复制、转录、重组和修复等核心生命过程中起着关键作用，通过引入单链或双链断裂解开DNA的超螺旋结构，促进这些过程的精确进行。ASFV的II型DNA拓扑异构酶pP1192R在病毒感染的中晚期阶段高度活跃，是病毒复制的关键酶（Nucleic Acids Res，2024）。
本团队利用多种结构生物学手段，解析了pP1192R全酶活周期中多个酶活阶段的分子构象。在全面评估了Topo II抑制剂对pP1192R的靶向性后，发现仅真核Topo II抑制剂m-AMSA特异性阻断pP1192R的酶活功能，并显著抑制ASFV在猪肺泡巨细胞(PAM)中的复制。随后，研究团队解析了pP1192R-DNA-m-AMSA三元复合物结构，从生化和结构两个角度揭示了m-AMSA对pP1192R的双重抑制机制。除通过传统的捕获Topo II-DNA共价复合物的机制抑制酶活功能外，研究首次发现Topo II抑制剂可以通过阻止DNA断裂并稳定非共价的Topo II-DNA复合物的机制抑制Topo II的酶活功能。此外，通过解析pP1192R对DNA的预切割状态的分子构象，研究首次发现了桥接Topo IIDNA酶切活性氨基酸和DNA磷酸骨架间的金属离子(A2+)。这一发现为Topo II的双离子依赖的DNA切割机制提供了直接证据（Nucleic Acids Res，2024）。
非洲猪瘟病毒关键蛋白的分子机制与抑制剂研究
解析了ASFV dUTP焦磷酸酶（dUTPase）apo-E165R和E165R-dUMP复合体的晶体结构，分析确定了酶活性位点的结构，以及与配体dUMP之间的相互作用位点。进一步通过比对ASFV-E165R与其它物种的dUTPase的结构，发现E165R的活性位点与结核分枝杆菌和恶性疟原虫的dUTPase的活性位点高度相似。而结核分枝杆菌和恶性疟原虫的dUTPase已被证明能够作为药物设计的靶点，如α,β-imido-dUTP（dUPNPP）已被用来抑制结核分枝杆菌的dUTPase活性；一些脱氧尿苷三苯基甲烷衍生物也被发现具有抗疟活性。因此针对ASFV-E165R活性位点开发的小分子化学药物很可能对预防和控制ASFV有效。因此研究结果为靶向E165R的抗ASFV药物设计提供了重要依据（mBio,2019）。
E165R-dUMP与其它物种dUTPases-产物/抑制剂的结构
首次绘制了ASFV感染的原代巨噬细胞基因表达全景式图谱，揭示病毒与宿主分子之间的关联模式以及病毒复制所调控的宿主细胞信号通路。利用ASFV感染的原代猪肺泡巨噬细胞，通过单细胞转录组测序技术，发现不同ASFV基因的表达模式存在时间规律性，这为病毒基因的功能注释提供了重要依据。此外，本团队还发现巨噬细胞的基因表达模式在病毒暴露环境下会发生明显变化，其中干扰素刺激基因、炎症反应相关基因、细胞因子相关基因的表达均出现显著上调。本研究为解析ASFV感染诱导免疫细胞大量衰竭进而无法建立有效的抗病毒应答提供了重要科学依据，并为深入阐明ASFV致病机制提供了理论基础（Proc Natl Acad Sci U S A，2020）。
参考文献
1. Liu R, Sun Y, Chai Y, Li S, Li S, Wang L, Su J, Yu S, Yan J, Gao F, Zhang G, Qiu HJ, Gao GF, Qi J, Wang H. The structural basis of African swine fever virus pA104R binding to DNA and its inhibition by stilbene derivatives. Proc Natl Acad Sci U S A 2020; 117(20):11000-11009.
2. Liu S, Luo Y, Wang Y, Li S, Zhao Z, Bi Y, Sun J, Peng R, Song H, Zhu D, Sun Y, Li S, Zhang L, Wang W, Sun Y, Qi J, Yan J, Shi Y, Zhang X, Wang P, Qiu HJ, Gao GF. Cryo-EM Structure of the African Swine Fever Virus. Cell Host Microbe 2019; 26(6):836-843 e833.
3. Liu R, Sun J, Li LF, Cheng Y, Li M, Fu L, Li S, Peng G, Wang Y, Liu S, Qu X, Ran J, Li X, Pang E, Qiu HJ, Wang Y, Qi J, Wang H, Gao GF. Structural basis for difunctional mechanism of m-AMSA against African swine fever virus pP1192R. Nucleic Acids Res 2024; 52(18):11301-11316.
4. Li C, Jia M, Hao T, Peng Q, Peng R, Chai Y, Shi Y, Song H, Gao GF. African swine fever virus A137R assembles into a dodecahedron cage. J Virol 2024; 98(3):e0153623.
5. Wang L, Luo Y, Zhao Y, Gao GF, Bi Y, Qiu HJ. Comparative genomic analysis reveals an 'open' pan-genome of African swine fever virus. Transbound Emerg Dis 2020; 67(4):1553-1562.
6. Zheng Y, Li S, Li SH, Yu S, Wang Q, Zhang K, Qu L, Sun Y, Bi Y, Tang F, Qiu HJ, Gao GF. Transcriptome profiling in swine macrophages infected with African swine fever virus at single-cell resolution. Proc Natl Acad Sci U S A 2022; 119(19):e2201288119.
7. Li C, Chai Y, Song H, Weng C, Qi J, Sun Y, Gao GF. Crystal Structure of African Swine Fever Virus dUTPase Reveals a Potential Drug Target. mBio 2019; 10(5).
8. Yue C, Xiang W, Huang X, Sun Y, Xiao J, Liu K, Sun Z, Qiao P, Li H, Gan J, Ba L, Chai Y, Qi J, Liu P, Qi P, Zhao Y, Li Y, Qiu HJ, Gao GF, Gao G, Liu WJ. Mooring Stone-Like Arg(114) Pulls Diverse Bulged Peptides: First Insight into African Swine Fever Virus-Derived T Cell Epitopes Presented by Swine Major Histocompatibility Complex Class I. J Virol 2022; 96(4):e0137821.